产品名称：

英文名称：Xylophilus ampelinus PCR Kit

中文名称：葡萄细菌性疫病菌PCR试剂盒

包装规格：50T/盒

预期用途

细菌性疫病是由黄单孢杆菌（属细菌）侵染所致。病菌主要在种子内越冬，也可随病残体在土壤中越冬。本产品就是根据 PCR 原理开发检测葡萄细菌性疫病菌的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增葡萄细菌性疫病菌，与其他细菌没有交叉反应。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

葡萄细菌性疫病菌PCR试剂盒检验原理

本试剂盒采用 PCR 技术，针对葡萄细菌性疫病菌的基因高度保守区域设计特异性引物，用 PCR 技术对葡萄细菌性疫病菌的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含葡萄细菌性疫病菌核酸模板的情况下，PCR 反应进行特异性扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术对 PCR 扩增产物进行检测，依据特异性扩增片段的结果，判断待检样品中是否含有猪细小病毒源性成分，实现检测结果的定性分析。

试剂组成：

名称	规格
葡萄细菌性疫病菌扩增液	50μL×1管
葡萄细菌性疫病菌反应液	950μL×1管
葡萄细菌性疫病菌阳性质控品	50μL×1管
葡萄细菌性疫病菌阴性质控品	50μL×1管
说明书	1份

实验说明

1. 不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

2. 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

储存条件及有效期

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。

适用仪器

无 DNA/RNA 酶的 1.5mL 离心管，0.2mL PCR 反应管，滤芯吸头(规格:10μL,200μL,1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器，琼脂糖，电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统。

样品要求

1. 根据实际情况可采取食品、粪便、呕吐物、口腔样本，唾液、咽喉部鼻孔眼部和肛门拭子及病毒培养物作为检测样本。

2. 应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。

样品保存和运输

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

使用方法

1. 样品处理（样本处理区）

2. 样本前处理

取悬浮的口腔样本或粪便样本 100ul，加入 1.5ml 离心管中，用 DNA 核酸提取试剂盒进行提取即可。

DNA 提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。

推荐采用我们公司研发生产的试剂盒：Hypure 病毒基因组 DNA 提取试剂盒(离心柱法) 

试剂配制（试剂准备区）

1. 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2. 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体

系配制如下表：

试剂	葡萄细菌性疫病菌反应液	葡萄细菌性疫病菌扩增液
用量（样本数为N）	19μL	1μL

3. 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s，按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。

4. 盖紧八联 PCR 反应管盖, 并注意做好相应标识（请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间）。将 PCR 反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

备注：模板浓度高或存在 PCR 抑制物，需用超纯水稀释模板 DNA，DNA 浓度低于 50ng/ul，可加 5μL 模板，高浓度 DNA 可能抑制 PCR 反应。

PCR 扩增（核酸扩增区）

将待检测反应管置于 PCR 仪反应槽内, 并记录放置顺序；

推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间
1	1 cycle	95℃	3min
2	35 cycle	95℃	10sec
		58℃	15sec
		72℃	20sec
3	1 cycle	72℃	5min
4	1 cycle	4℃	Hold

结果分析判定

电泳检测

取 10-20 μL PCR 产物。电泳检测 PCR 产物。本产品提供的扩增液在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。

电泳结果判断

PCR 产物阳性对照必须有目的片段大小的条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排除PCR 抑制剂的感染。

检测方法的局限性

* 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

* 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

* 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

* 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

* 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。

注意事项

* 所有操作严格按照说明书进行；

* 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；

* 反应液应避光保存；

* 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

* 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

* 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

* 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

* 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，试剂盒严格按照说明书操作，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！